Integriertes Mikrobiom

Scientific Data Band 10, Artikelnummer: 280 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Eine übermäßige Fettablagerung kann Stoffwechselerkrankungen auslösen, und es ist wichtig, Faktoren zu identifizieren, die den Zusammenhang zwischen Fettablagerung und Stoffwechselerkrankungen aufheben können. Gesunde fettleibige Laiwu-Schweine (LW) haben einen hohen Fettgehalt, sind aber resistent gegen Stoffwechselerkrankungen. In dieser Studie verglichen wir das Kotmikrobiom, das Kot- und Blutmetabolom sowie das Genom von LW- und Lulai-Schweinen (LU), um Faktoren zu identifizieren, die den Zusammenhang zwischen Fettablagerung und Stoffwechselerkrankungen blockieren können. Unsere Ergebnisse zeigen signifikante Unterschiede zwischen LW und LU bei Spirochäten und Treponema, die am Kohlenhydratstoffwechsel beteiligt sind. Die Zusammensetzung des Kot- und Blutmetaboloms war ähnlich, und einige antimetabolische Krankheitsbestandteile der Blutmetaboliten unterschieden sich zwischen den beiden Schweinerassen. Die vorhergesagte differenzielle RNA ist hauptsächlich im Lipidstoffwechsel und im Glukosestoffwechsel angereichert, was mit den Funktionen differenzieller Mikrobiota und Metaboliten übereinstimmt. Das herunterregulierte Gen RGP1 ​​korreliert stark negativ mit Treponema. Unsere Omics-Daten würden wertvolle Ressourcen für die weitere wissenschaftliche Forschung zu gesunder Fettleibigkeit bei Menschen und Schweinen liefern.

Eine übermäßige Fettablagerung kann zu chronischen Organschäden und Stoffwechselerkrankungen führen1,2,3. Genetische Faktoren allein können diese Erkrankungen jedoch nicht vollständig erklären4. Die Rolle von Stoffwechselfaktoren wie Darmmikrobiota und Metaboliten5,6,7,8 hat beim Verständnis der Ursachen von durch Fettleibigkeit verursachten chronischen Stoffwechselerkrankungen zunehmend an Bedeutung gewonnen9,10,11. Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota können nachweislich chronische Stoffwechselerkrankungen auslösen, darunter Bluthochdruck, Arteriosklerose und Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM)12,13,14. Mikrobiota produzieren essentielle Metaboliten wie Trimethylamin-N-oxid (TMAO) und stehen in direktem Zusammenhang mit chronischen Stoffwechselerkrankungen wie Arteriosklerose, T2DM, Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) und Schlaganfall15,16,17,18. Darüber hinaus kann die Darmmikrobiota nicht absorbierte/unverdaute Kohlenhydrate fermentieren, um aliphatische organische Säuren wie kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) zu produzieren19,20. SCFAs können den Wirt über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren vor ernährungsbedingter Fettleibigkeit schützen, und Mikrobiota regulieren indirekt den Lipidstoffwechsel des Wirts über SCFAs21,22,23. Somit fungieren Darmmikroben als endokrines Organ und produzieren bioaktive Metaboliten, die die Physiologie des Wirts beeinflussen7,24,25,26. Umgekehrt haben neuere Studien gezeigt, dass das Wirtsgenom verwandte Phänotypen beeinflussen kann, indem es die Darmmikrobiota verändert. Beispielsweise können ABO-Genotypen die Struktur der Darmmikrobiota beeinflussen, indem sie N-Acetylgalactosamin (GalNAc) regulieren27. Daher kann die Integration der Omics-Analyse dabei helfen, Schlüsselfaktoren zu identifizieren, die Menschen vor Stoffwechselerkrankungen schützen.

Schweine neigen dazu, resistent gegen Stoffwechselerkrankungen wie die nichtalkoholische Fettleber (NAFLD), T2DM und CVD zu sein, obwohl sie mit Futter gefüttert werden, das viel Fett, Fruktose und Kohlenhydrate enthält28,29. Dieses Phänomen ähnelt der metabolischen gesunden Fettleibigkeit (MHO), die zwar fettleibig ist, aber vor Stoffwechselerkrankungen schützt30. Das chinesische Laiwu-Schwein (LW) ist für seinen hohen Fettgehalt bekannt, einschließlich subkutanem Fett und intramuskulärem Fett (IMF)31,32,33,34. Insbesondere lag der IWF von LW bei über 7 %, der Durchschnitt bei bis zu 11,6 % und der höchste Einzelwert bei bis zu 21 %. LW wurde mit dem westlichen kommerziellen Schwein Yorkshire-Schwein (YS) gekreuzt, um das Lulai-Schwein (LU) zu züchten, das eine 50-prozentige LW-Geninfiltration aufweist35. Der Fettgehalt von LU war niedriger als der von LW, und der IWF betrug etwa 5 %. In dieser Studie wählten wir acht LW- und acht LU-Schweine mit ähnlichen Ernährungs-, Hygiene- und Umweltbedingungen für die zentrale Verwaltung über einen Zeitraum von zwei Jahren aus (Tabelle 1). Wir haben das fäkale Mikrobiom, das fäkale Metabolom, das Blutmetabolom und das gesamte Genom der Zielschweine (wie in Abb. 1 dargestellt) verarbeitet, um durch Omics-Integrationsanalyse Schlüsselfaktoren zu identifizieren, die Einzelpersonen vor Stoffwechselerkrankungen schützen.

Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs für die Mikrobiom-Metabolom-Genom-Omics-Probensammlung, Probenverarbeitung und Datenverarbeitung.

Zusammenfassend hat unsere Studie einen hochwertigen Datensatz von Kotmetagenomen, Kotmetabolomen, Blutmetabolomen und Gesamtgenomsequenzen von LW- und LU-Schweinen generiert. Das fäkale Metagenom produzierte 34,5 Gigabyte (Gb) und 35 Gb an unassemblierten Rohdaten und zeigte signifikante Unterschiede in der Häufigkeit von Spirochäten und Treponema, die am Kohlenhydratstoffwechsel beteiligt sind. Wir identifizierten insgesamt 1.220 Metaboliten im Stuhlmetabolom und 713 Metaboliten im Blutmetabolom, die beide reich an mittel- und langkettigen Fettsäuren waren. Das Blutmetabolom enthielt einige antimetabolische Krankheitsbestandteile wie Hydroxyfettsäuren, Tanshinon IIA und Betain. Das gesamte Genom erhielt durchschnittlich 21,9 Gb Paired-End-Reads mit einer Gesamtzahl von 23,5 Millionen Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) aus 18 Autosomen. Die Fst-Analyse (Fixierungsindex, Wrights F-Statistik) von SNPs identifizierte 4 KEGG-Signalwege (Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome), einschließlich Gallensekretion sowie Fettverdauung und -absorption, die im obersten 1 % von Fst angereichert waren. Die RNA-Expressionsanalyse von Fettgewebe von 16 Schweinen identifizierte 412 unterschiedlich exprimierte Gene, die in 9 KEGG-Signalwegen angereichert waren, einschließlich des Stärke- und Saccharose-Metabolismus und des Glycerophospholipid-Metabolismus. Die funktionelle Annotation differenzieller Gene zeigte, dass der Lipid- und Glukosestoffwechsel die wichtigsten angereicherten Funktionen waren, was mit den Funktionen differenzieller Mikrobiota und Metaboliten übereinstimmt. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass das herunterregulierte Gen RGP1 ​​stark negativ mit Treponema korreliert, was darauf hindeutet, dass die Expression von RGP1 ​​eng mit der Veränderung der Treponema-Häufigkeit zusammenhängt. Zusammenfassend liefert unsere Studie neue Erkenntnisse über die Rolle von Darmmikrobiota, Metaboliten und Wirtsgenetik bei der Entstehung von Stoffwechselerkrankungen. Die Identifizierung von anti-Adipositas- oder antimetabolischen Krankheitsfaktoren durch die Integration mikrobiomischer, metabolomischer und genomischer Daten hat das Potenzial, zur Entwicklung neuer Therapiestrategien für diese Krankheiten zu führen.

Unser Experiment war darauf ausgelegt, acht weibliche Laiwu-Schweine (LW) mit acht weiblichen Lulai-Schweinen (LU) zu vergleichen, die zwischen LW- und Yorkshire-Rassen gekreuzt waren. Alle Schweine wurden etwa zwei Jahre lang (715 ± 33 Tage, Tabelle 1) unter einheitlichen Haltungs- und Fütterungsbedingungen auf der Schweinefarm Jing-Qi-Shen in der chinesischen Provinz Jilin geboren und aufgezogen. Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Licht variierten je nach den natürlichen Klimabedingungen. Es wurden Ferkel verschiedener Mütter verwendet und ein Ferkel pro Wurf zufällig ausgewählt. Die Ferkel waren ähnlich alt, wobei der Abstand zwischen den ältesten und jüngsten Schweinen im Experiment 66 Tage betrug. Während der Säugezeit blieben die Ferkel bei ihrer Mutter und wurden dann in einen Schweinestall mit Futterautomaten überführt. Die Ferkel wurden fünfmal täglich gefüttert, dreimal vor der Paarung und einmal morgens und abends nach der Trächtigkeit. Als die Sauen geschlechtsreif waren, nahmen sie an der normalen sexuellen Paarung und Geburt teil. Die Sauen waren zum Zeitpunkt der Probenentnahme nicht trächtig.

Die Kotzeiten der Schweine waren unregelmäßig und die Probenentnahme erfolgte zwischen 10 und 17 Uhr. Es wurden Kot- und Blutproben entnommen. Um die Kotproben frei von Verunreinigungen zu halten, tragen wir saubere, sterile Einweghandschuhe und fangen Schweinemist auf, bevor er den Boden berührt. Die frischen Stuhlproben wurden sofort in Probensammelröhrchen konserviert, die mit einem bakteriellen DNA-Schutzmittel vorbereitet und vorgefüllt waren. Die Stuhlproben wurden dann zur schnellen Abkühlung in flüssigen Stickstoff gegeben. Von jedem Schwein wurden zwei Röhrchen mit Stuhlproben entnommen, eines zur Mikrobiom-Profilierung und eines zur Metabolom-Profilierung. Die gleiche Schweinegruppe wurde vor der Blutentnahme 14 Stunden lang über Nacht gefastet. Mit einer Spritze wurden fünf Milliliter Blut aus der Halsvene jedes Schweins entnommen. Das frische Blut wurde in einem Blutgerinnungsröhrchen aufbewahrt und eine Stunde lang bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die Blutmischung wurde dann 10 Minuten lang bei 4 °C und 3.000 g zentrifugiert. Das obere Blutserum wurde in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen überführt. Alle Stuhl- und Blutproben wurden beschriftet und mit Trockeneis zur weiteren Verarbeitung ins Labor transportiert.

Wir haben das EZNAsoil DNA-Isolierungskit (OMEGA, Norcross, GA, USA) verwendet, um Mikrobiota-DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren. Zur Beurteilung der DNA-Integrität und DNA-Qualität wurden eine Absorption bei einer optischen Dichte (OD) von 1,8 bis 2,0 und eine 1 %ige Agarosegelelektrophorese eingesetzt, und unsere Proben-DNA erfüllte diese Kriterien. Die gesamte DNA-Sequenz wurde mit einem Covaris M220-System (Qsonica, USA) in kurze Fragmente geschnitten. Die 300-bp-Fragmente wurden mithilfe eines TruSeq™-DNA-Probenvorbereitungskits (Illumina, San Diego, CA) zu einer Pair-Ends-Bibliothek (PE-Bibliothek) konstruiert. Die PE-Bibliothek wurde mit dem Truseq PE-Cluster-Kit v3-cBot-HS (Illumina, San Diego, CA) bewertet und die Bibliotheksfragmentamplifikation wurde mithilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt. Wir haben 1,5 μg Proben für das Next Generation Sequencing (NGS) in einem Illumina NovaSeq verwendet. 6000-Plattform.

Die ausgegebenen NGS-Sequenzierungsdaten wurden im Fastq-Format gespeichert. Rohdaten wurden zur Qualitätskontrolle mit Trimmomatic36 (v0.39) überprüft und anhand der folgenden Kriterien verarbeitet: (a) Wenn der durchschnittliche Massenwert innerhalb des eingestellten 50-bp-Schiebefensters niedriger als 20 war, war das Ende der Nichtkonformitätsqualitätsablesungen verlassen; (b) diejenigen Sequenzen, die zwei unbekannte Nukleotide enthielten (mit N markiert), wurden aufgegeben; (c) Sequenzen mit Adapterkontamination wurden ausgeschlossen; (d) Sequenzlängen unter 50 bp und Schwanzmassenwerte unter 20 wurden ausgeschlossen. Nach dem Zuschneiden blieben qualitativ hochwertige Sequenzen erhalten. Um die aus dem Wirtsgenom erhaltenen Sequenzen auszuschließen, wurden die verbleibenden Sequenzen auf das Schweine-DNA-Referenzgenom (Sscrofa 11.1) abgebildet und Burrows-Wheeler Aligner37 (v0.7.17) wurde verwendet, um die Lesevorgänge mit hoher Ähnlichkeit zu entfernen. Die restlichen Sequenzen wurden mit Megahit38 (v1.1.1) de novo zu Contigs zusammengesetzt. Schließlich wurden die offenen Leserahmen (ORFs) der sich zusammensetzenden Contigs mithilfe von MetaGeneMark39 (v3.25) vorhergesagt. Die Sequenzen wurden mit CD-HIT40 geclustert, wobei die Parameter auf 95 % Konsistenz und 90 % Abdeckung eingestellt waren. Die längsten Sequenzen jedes Clusters wurden ausgewählt, um einen nicht-redundanten Genkatalog zu erstellen. Anschließend wurden die oben genannten verbleibenden Sequenzen hoher Qualität mit SOAPaligner41 mit dem nicht-redundanten Genkatalog (auf 95 % Identität eingestellt) verglichen und wir erhielten einen bestimmten Gensatz und eine bestimmte Genhäufigkeit. Der Gensatz wurde mithilfe von BLAST (v2.2.28) mit der Non-Redundant Protein Sequence-Datenbank (NR-Datenbank) verglichen, um die taxonomische Annotation und Häufigkeit zu erhalten (der Ausrichtungsparameter e-value wurde auf 1e-5 festgelegt). Abschließend wurden die taxonomischen Häufigkeiten der sechs Klassifikationsebenen Königreich, Stamm, Klasse, Ordnung, Familie, Gattung und Art analysiert.

Stuhl- und Blutproben wurden getrennt entnommen und analysiert. Vor der Probenverarbeitung haben wir vorab drei Qualitätskontrollproben (QC) vorbereitet, bei denen es sich um gemischte LW- und LU-Proben in gleichen Mengen handelte. Anschließend wurden LW-, LU- und QC-Proben durch Mischen mit 100 μl vorgekühltem Wasser und 800 μl vorgekühltem Methanol/Acetonitril (1:1, Vol./Vol.) auf 100 μl aufgetrennt. Die Mischungen wurden auf das Eisbad gegeben und 60 Minuten lang Ultraschall ausgesetzt. Um die Proteine ​​auszufällen, wurden die Gemische in einen Kühlschrank bei −20 °C überführt und eine Stunde lang inkubiert. Der Überstand wurde in saubere sterile Röhrchen überführt und 20 Minuten bei 16.000 g und 4 °C zentrifugiert. Als nächstes verwendeten wir eine Hochgeschwindigkeits-Vakuumanreicherungszentrifuge, um den Überstand zu trocknen. Das getrocknete Pulver wurde durch Zugabe von 100 μl Acetonitril/Wasser-Lösung (1:1, Vol./Vol.) resuspendiert und diese Lösung 15 Minuten lang bei 16.000 g und 4 °C zentrifugiert.

Die chromatographische Trennung wurde mit der Agilent 1290 Infinity LC Ultra-High Performance Liquid Chromatography (UHPLC)-Plattform mit einer Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie (AB Sciex Triple TOF 5600) und einer HILIC-Säule (Agilent 1290 Infinity) durchgeführt. QC-Proben, die zur Bewertung der Systemstabilität und Datenzuverlässigkeit verwendet wurden, wurden in die Probenwarteschlange eingefügt. Die Säulentemperatur betrug 25 °C und die Flussrate betrug 0,3 ml/min. Es gab zwei mobile Phasen, Phase A enthielt Wasser, 25 mM Ammoniumacetat und 25 mM Ammoniakwasser, Phase B enthielt nur Acetonitril. Das Laufverfahren des Systems der mobilen Phase wurde wie folgt eingestellt: 95 % B bei 0–0,5 Minuten; 95 % bis 65 % von B nach 0,5–7 Minuten; 65 % bis 40 % von B nach 7–9 Minuten; 40 % B bei 9–10 Min. aufrechterhalten; 40 % bis 95 % von B nach 10–11,1 Minuten; 95 % B wurden nach 11,1–16 Min. aufrechterhalten.

Der positive oder negative Ionenmodus der Komponenten wurde mithilfe der Elektrospray-Ionisation (ESI) nachgewiesen. Die ESI-Quellenbedingung wurde wie folgt eingestellt: Ionenquellengas1 (Gas1), 60 psi; Ionenquellengas2 (Gas2), 60 psi; Vorhanggas (CUR), 30 psi; Quellentemperatur, 600 °C; Ionenparallele Floating-Spannung (ISVF), ±5500 V; TOF-MS-Scan m/z-Bereich, 60–1200 Da; Produktion-Ionen-Scan-m/z-Bereich, 25–1200 Da; TOF-MS-Scan-Akkumulierungszeit, 0,15 s/Spektren; Produktion-Ionen-Scan-Akkumulierungszeit, 0,03 s/Spektren. Die sekundäre Massenspektrometrie wurde mittels informationsabhängiger Erfassung (IDA) durchgeführt und im hochempfindlichen Modus, Declustering-Potenzial (DP), ±60 V verwendet; Kollisionsenergie, 30 eV. IDA wurde wie folgt festgelegt: Isotope innerhalb von 4 Da ausschließen; Kandidatenionen, die pro Zyklus überwacht werden sollen, 6.

Die Rohdaten der Massenspektrometrie (MS) wurden von ProteoWizard in mzXML-Dateien konvertiert. Das Programm XCMS in der MSDIAL-Software wurde zur Peakausrichtung, Korrektur der Retentionszeit und Extraktion der Peakfläche verwendet. Für die extrahierten Daten wurden die Ionenpeaks mit fehlenden Werten >50 % in der Gruppe entfernt. Anschließend wurden die positiven und negativen Ionenpeaks integriert und zur Mustererkennung die Software SIMCA-P 14.1 (Umetrics, Umea, Schweden) verwendet. Zur Identifizierung der Metabolitenstruktur wurden ein genauer Massenabgleich (<25 ppm) und ein Sekundärspektrumabgleich verwendet und Datenbanken wie die Human Metabolome Database (HMDB) und die Massbank Database durchsucht. Nach dem Abrufen der Metaboliten wurden die Metaboliten mithilfe der MSDIAL-Suchsoftware klassifiziert. Die Daten wurden für die anschließende Analyse durch Pareto-Skalierung normalisiert.

Die Blut-DNA-Extraktion wurde gemäß dem Protokoll des TruSeq DNA LT Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) durchgeführt. Die DNA-Qualität wurde durch Messung der Absorption bei OD 1,6 bis 1,8 mit einem NanoDrop 2000-Spektrophotometer (Thermo Fischer Scientific, USA) bewertet, während die DNA-Integrität durch 1 % Agarosegelelektrophorese bestätigt wurde. Anschließend wurde die DNA-Sequenz mit Covaris M220 in 350–450 bp große Fragmente fragmentiert. Die Fragmentenden wurden repariert und phosphoryliert, gefolgt von der Verbindung des Adapters mit dem NextFlexTM Rapid DNA-Seq Kit (Bioo Scientific, USA). Abschließend wurde die Bibliothek über 15 PCR-Zyklen amplifiziert, um kleine Fragmente anzureichern. Die Qualität und Konzentration der Bibliothek wurden mit Qubit (Thermo Fischer Scientific, USA) bestimmt und die PE150-Sequenzierung wurde auf dem Illumina NovaSeq durchgeführt. 6000-Plattform.

Die Sequenzierungsdaten wurden im Fastq-Format gespeichert. Zum Lesen, Filtern und Profilieren der Qualität der Lesevorgänge wurde Fastp42 (v0.20.0) mit Standardparametern verwendet. BWA37 (v0.7.17) wurde verwendet, um qualitativ hochwertige Reads auf das Referenzgenom des Schweins (Sscrofa11.1) abzubilden. SAM-Dateien wurden von SamTools43 (v1.10) in BAM-Dateien konvertiert. Doppelte Lesevorgänge wurden mit Sambamba44 (v0.7.1) entfernt. Die Datenabdeckung und -tiefe wurden mit Mos Depth45 (v0.2.9) berechnet. GATK46 (v4.1.6) Haplotypecalle wurde verwendet, um jede Probe zu verarbeiten und einen Zwischen-GVCF zu generieren, der für die gemeinsame Genotypisierung aller Proben in Genotyp-GVCFs verwendet wurde. Schließlich wurden SNPs anhand der folgenden Kriterien gefiltert: (1) QD <2,0, FS > 60,0, MQ <40,0, MQRankSum <–12,5, ReadPosRankSum <–8,0, SOR > 3,0; (2) Minor-Allel-Häufigkeit (MAF) < 0,01; (3) Aufrufrate von GATK-Varianten < 0,9. Die Anzahl der erhaltenen SNPs ist in Tabelle 4 aufgeführt. Die Verteilung der Genotypdichte wurde mit dem CMplot R-Paket kartiert. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde mit Plink47 (v1.9) berechnet. Die Analyse der genetischen Struktur der Population wurde mit Admixture48 (v1.3.0) durchgeführt. PCA- und Admixture-Analysen umfassten die SNPs von Yorkshire-Schweinen (YS), Duroc-Schweinen (DU) und Landrace-Schweinen (LR), die aus der PHARP-Datenbank49 (http://alphaindex.zju.edu.cn/PHARP/index.php) bezogen wurden. . Die FST-Analyse wurde mit VCFtools50 (v0.1.13,–fst-window-size 50.000–fst-window-step 10.000. Fenstergröße 50 K, Schrittgröße 10 K) durchgeführt. Die Vorhersage der Genexpression wurde mit dem FarmGTEx TWAS-Server51,52 (http://twas.farmgtex.org/) durchgeführt. Die funktionale Annotation für Genontologie (GO) und KEGG wurde unter Verwendung von http://kobas.cbi.pku.edu.cn/ durchgeführt.

Das fäkale Metagenom generierte 34,5 GB bzw. 35 GB nicht zusammengesetzter Rohdaten aus LW- bzw. LU-Proben. Nach der Qualitätskontrolle überstieg das Q20-Verhältnis der Sequenz (Basen mit einem Massenwert von 20 als Prozentsatz der Gesamtzahl der Basen) 96,99 % und das Q30-Verhältnis über 91,67 %, was darauf hinweist, dass die Datenqualität für die weitere Analyse geeignet war. Im Durchschnitt wurden 5,5 Millionen bzw. 5,7 Millionen saubere Lesevorgänge aus LW- bzw. LU-Datensätzen erhalten (Tabelle 2). Die Intergruppendiversität der Sequenzen zwischen den beiden Schweinerassen wurde mithilfe des Shannon- und Simpson-Diversitätsindex berechnet, und es gab keinen nennenswerten Unterschied in den Gesamtsequenzen (Abb. 2C, D). Die LU-Gruppe wurde mit 50 % der LW-Gene infiltriert und etwa zwei Jahre lang in einer gleichbleibenden Umgebung gehalten, was möglicherweise für die unterschiedslose mikrobielle Zusammensetzung der beiden Schweinegruppen verantwortlich ist. Saubere Lesevorgänge wurden zu Contigs zusammengestellt und basierend auf 95 % Ähnlichkeit und 90 % Abdeckung geclustert, um einen nicht-redundanten Genkatalog zu erstellen, der insgesamt 4,2 Millionen ORFs mit einer durchschnittlichen Länge von 622 Basenpaaren umfasst. Die Genanmerkung ergab, dass 262.645 Gene nur für LU und 350.102 Gene nur für LW galten (Abb. 2A). Obwohl LU mehr Sequenzen und Contigs als LW hatte, hatte es weniger annotierte Gene. Im Gegensatz zu früheren Berichten über die geringere Genzahl und Bakterienvielfalt bei fettleibigen Personen53,54,55 zeigen unsere Ergebnisse, dass fettleibigere Schweine eine höhere Genzahl aufweisen, was im Widerspruch zum vorherigen Befund steht. Die kumulative Häufigkeitsstatistik der Genhäufigkeiten der beiden Schweinerassen zeigte in den meisten Intervallen keinen signifikanten Unterschied, aber Gene mit einer Anzahl von fast 40 waren in LW signifikant häufiger als in LU (Abb. 2B). Dieser Befund weist darauf hin, dass die beiden Schweinerassen unterschiedliche Zusammensetzungen aufweisen, die hauptsächlich in diesem Intervall liegen.

Mikrobielle Genstatistik und Diversitätsvergleich zwischen LW und LU. (A) Genstatistik. (B) Kumulative Häufigkeitsstatistik von Genen. (C) Shannon-Diversitätsindex. (D). Simpson-Diversitätsindex.

Die sehr ähnliche mikrobielle Umgebung von LW und LU kann auf den hohen Grad der Geninfiltration und der Aufzuchtumgebung zurückgeführt werden. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass die verbleibenden differenziellen Mikroorganismen an der Fettablagerung beteiligt sind, was zu Unterschieden im Fettgehalt der beiden Schweinerassen führt. Daher haben wir weitere Analysen durchgeführt, um die mikrobiellen Unterschiede zwischen LW und LU zu identifizieren. Wir haben das Mikrobiom auf sechs taxonomischen Klassifizierungsebenen zusammengefasst, darunter Stamm, Klasse, Ordnung, Familie, Gattung und Art. In LW haben wir insgesamt 146 Phyla, 90 Klassen, 323 Ordnungen, 304 Familien, 2.691 Gattungen und 14.570 Arten entdeckt (Tabelle 3). Inzwischen zeigte LU 145 Phyla, 90 Klassen, 321 Ordnungen, 306 Familien, 2.651 Gattungen und 14.324 Arten (Tabelle 3). Aufgrund unbekannter taxonomischer Anmerkungen auf Klassen- und Familienebene waren die Statistiken niedriger. Auf der Ebene der Phylum-Klassifizierung waren Firmicutes (66,94 %), Bacteroidetes (17,93 %) und Proteobacteria (5,69 %) die vorherrschenden Phyla, gefolgt von Actinobacteria (2,38 %), Spirochaetes (1,46 %), Fibrobacteres (0,62 %) und Planctomycetes ( 0,5 % sind ebenfalls in erheblichen Mengen vorhanden (Abb. 3A, Ergänzungstabelle S5). Der Gesamtanteil von Firmicutes, Bacteroidetes und Proteobacteria erreichte 91 %, wobei die Nischenkonkurrenz am stärksten war, da das Verhältnis ausgeglichen war (Ergänzungstabelle S1). Auf der Ebene der Gattungsklassifizierung waren die vorherrschenden Gattungen Clostridium (6,55 %), Bacteroides (4,93 %), Prevotella (7,15 %), Streptococcus (4,2 %), Oscillibacter (4,05 %), Ruminococcus (3,39 %), Faecalibacterium (1,8 %). ) und Eubacterium (1,8%) (Abb. 3B, Ergänzungstabelle S2). Wir führten einen Wilcoxon-Rangsummentest durch, um die Unterschiede zwischen den taxonomischen Ebenen von LW und LU im Stamm und in der Gattung zu analysieren. Die Ergebnisse zeigten einen signifikanten Unterschied in der Spirochätenhäufigkeit zwischen LW und LU auf der Ebene der Phylumklassifizierung (Abb. 4A). Es wurde berichtet, dass Spirochäten am Stoffwechselprozess von Kohlenhydraten beteiligt sind56,57,58,59. Auf der taxonomischen Ebene der Gattung gab es einen signifikanten Unterschied in der Treponema-Häufigkeit zwischen LW und LU (Abb. 4B). Treponema ist eine Gattung der Spirochäten.

Zusammensetzung der Mikrobiota mit hoher Häufigkeit in LW und LU. (A) Phylum-Klassifizierungsstufe. (B) Gattungsklassifizierungsebene.

Differenzielle Mikrobiota auf taxonomischer Ebene des Stammes und der Gattung in LW und LU. (A) Phylum-Klassifizierungsstufe. (B) Gattungsklassifizierungsebene.

Die Gesamtionenflussmuster (TIC) der Qualitätskontrollproben (QC) wurden im Positiv- und Negativ-Ionen-Detektionsmodus verglichen. Die Reaktionsstärke und die Retentionszeit jedes chromatographischen Peaks überlappten sich, was darauf hinweist, dass die durch Gerätefehler verursachte Variation minimal und die Datenqualität zuverlässig ist. Für das fäkale Metabolom extrahierten wir 12.226 positive Ionenpeaks und 6.891 negative Ionenpeaks, von denen 703 positive Ionenpeaks und 517 negative Ionenpeaks mit Anmerkungen versehen wurden. Die 1.220 kommentierten Metaboliten wurden in 453 Klassen eingeteilt, darunter Triterpenoide, langkettige Fettsäuren und Xanthophylle, mit 53, 19 bzw. 13 Arten von Metaboliten (Abb. 5A, Ergänzungstabelle S3). Im Blutmetabolom haben wir 5.977 positive Ionenpeaks und 3.081 negative Ionenpeaks nachgewiesen, von denen 368 positive Ionenpeaks und 345 negative Ionenpeaks annotiert waren. Die 713 kommentierten Metaboliten wurden in 360 Klassen eingeteilt, darunter Triterpenoide, Diterpenoidalkaloide vom Aconitan-Typ und Alpha-Aminosäuren mit jeweils 15, 14 und 11 Metaboliten (Abb. 5B, Ergänzungstabelle S4). Es ist erwähnenswert, dass langkettige und mittelkettige Fettsäuren die wichtigsten Fettsäuren sowohl im Stuhl- als auch im Blutmetabolom waren. Diese Fettsäuren lassen sich leicht oxidieren und hydrolysieren und können Blutfette und Cholesterin senken, was möglicherweise mit der geringeren Anfälligkeit von Schweinen für durch Fettleibigkeit bedingte Stoffwechselerkrankungen zusammenhängt. Die Zusammensetzung des Stuhlmetaboloms ähnelte der des Blutmetaboloms und enthielt Triterpenoide, Xanthophylle, langkettige Fettsäuren, mittelkettige Fettsäuren, Lipide und Alpha-Aminosäuren (Abb. 5A, B). Die Zusammensetzung der Hauptmetaboliten der beiden Metabolome ist sehr ähnlich und einige ihrer Substanzen sind wahrscheinlich verwandt.

Klassifizierung von Metaboliten des Stuhl- und Blutmetaboloms. (A) Fäkale Metabolom-Metaboliten. (B) Metaboliten des Blutmetaboloms. Die Anzahl der Metabolitenkomponenten ist in absteigender Reihenfolge geordnet. Die Zahlenwerte geben die Anzahl der Metaboliten pro Klasse an.

Blutmetaboliten spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der physiologischen Gesundheit, und das Verständnis ihres Einflusses kann Aufschluss darüber geben, wie Schweine vor Stoffwechselerkrankungen geschützt werden. Um dies zu untersuchen, analysierten wir das Blutmetabolom und maßen die Einflussintensität und Erklärungsfähigkeit von Metaboliten-Expressionsmustern mithilfe der variablen Wichtigkeit für die Projektion (VIP), die durch ein OPLS-DA-Modell ermittelt wurde. Wir haben Metaboliten mit VIP > 1 und P-Wert < 0,05 (einfaktorielle ANOVA für Mehrgruppenvergleich) ausgewählt, um diejenigen mit signifikanten Unterschieden zu identifizieren. Unsere Ergebnisse ergaben 81 Metaboliten, die sich zwischen den beiden Schweinegruppen signifikant unterschieden (Ergänzungstabelle S5). Davon waren 41 Metaboliten in LW häufiger anzutreffen, darunter Angelicin, Securinin, Hypoxanthin, Betain, Cytidin, Homocystein, Curdion, Inosin, Isopimpinellin, 5-Methoxypsoralen, Palmitoylcarnitin, Citrat, Stearinsäure, Cytarabin, Licochalcon A und N-Acetylneuraminsäure Säure. Andererseits waren 40 Metaboliten in LU häufiger anzutreffen, darunter Nitrazepam, Paracetamol, Icosansäure, Gabapentin, Spegatrin, Juarezinsäure, Dehydroeffusol, Gomisin H und DL-2-Hydroxyvaleriansäure. Bemerkenswert ist, dass einige dieser sich verändernden Blutmetaboliten möglicherweise mit dem Fettgehalt von Schweinen zusammenhängen, da gezeigt wurde, dass sie antiadipogenese- und antichronische Stoffwechselkrankheitseffekte haben. Beispielsweise wurde berichtet, dass Hydroxyfettsäuren eine antidiabetische und entzündungshemmende Wirkung haben60, und Tanshinon IIA wird zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen eingesetzt und hat antiadipogene Wirkung61,62,63. Betain hat anti-fettleber- und entzündungshemmende Eigenschaften, die Hyperglykämie verhindern und die Insulinresistenz reduzieren können64,65,66.

Die LW- und LU-Proben ergaben durchschnittlich 22 Gbit bzw. 21,9 Gbit Paired-End-Lesevorgänge, aus denen nach der Qualitätskontrolle 144,6 Millionen bzw. 143,5 Millionen saubere Lesevorgänge erzielt wurden. Die Qualität der Genomdaten war hoch, mit Q20-Verhältnissen aller Sequenzen über 95,69 % und Q30-Verhältnissen über 89,27 % (Ergänzungstabelle S6). Die durchschnittliche genomische Sequenzierungstiefe betrug das 6,8-fache, wobei die Abdeckung 97 % erreichte, und insgesamt 22,7 Millionen SNPs (Minor-Allel-Häufigkeit ≥ 0,05) wurden aus 18 Autosomen nach Assemblierung, SNP-Aufruf und SNP-Filterung erhalten (Tabelle 4). Die hohe Dichte der Nukleotiddiversität in einem nicht überlappenden Fenster von 1 MByte (Mb) deckt alle Genome ab (Abb. 6). PCA- und Beimischungsanalysen zeigten deutliche Unterschiede im Stammbaum von LW und LU, wobei sich die Schweinerassen LW und LU deutlich von den Schweinerassen Yorkshire unterschieden (Abb. 7A, B). Zusätzlich wurde die Fst-Methode verwendet, um die Auswahlsignaturen zwischen LW und LU zu erkennen. Der Fst-Spitzenwert lag bei bis zu 0,8, was bedeutet, dass ihre Gruppendifferenzierung relativ hoch ist (Abb. 7C). Top 1% Fst können 811 Genen zugeordnet werden (Ergänzungstabelle S7). Diese Gene wurden durch funktionelle Anreicherung annotiert, was zu 6 GO-Wegen und 4 KEGG-Wegen führte, einschließlich Gallensekretion sowie Fettverdauung und -absorption (Ergänzungstabelle S10). Die RNA-Expressionsanalyse mit dem FarmGTEx TWAS-Server sagte insgesamt 2.930 Gene in einzelnen Fettgeweben in LW und LU voraus, von denen 146 hochreguliert und 266 herunterreguliert waren (Ergänzungstabelle S8). Die unterschiedlichen Genfunktionen wurden annotiert, was zu 6 GO-Wegen und 9 KEGG-Wegen führte, einschließlich des Stärke- und Saccharosestoffwechsels sowie des Glycerophospholipidstoffwechsels (Ergänzungstabelle S10). Darüber hinaus identifizierte die Spearman-Korrelationsanalyse 42 Gene, die auf taxonomischer Ebene der Gattung stark mit der differenziellen Mikrobiota Treponema assoziiert sind, darunter 2 hochregulierte Gene (ENSSSCG00000025565 und ENSSSCG00000049578) und 1 herunterreguliertes Gen RGP1 ​​(| Cor | > 0,6, P-Wert < 0,05, Ergänzungstabelle S9). .

Verteilung von SNPs auf Chromosomen. Die x-Achse zeigt die Chromosomenposition (in MB) und die y-Achse stellt die Chromosomen dar. Verschiedene Farben entsprechen der Anzahl der SNPs in jedem 1-MB-Genomblock.

Stammbaum und Gruppendifferenzierung zwischen LW und LU. (A) Hauptkomponentenanalyseergebnisse der Schweinerassen LW, LU, YS, LR und DU. Blaue, orange, rote, violette und grüne Markierungen stehen für LW-, LU-, YS-, LR- und DU-Schweine. (B) Ergebnisse der Abstammungszusammensetzung mit der angenommenen Anzahl von Abstammungen bei K = 2. K ist ein einstellbarer Parameter, der die Anzahl möglicher Abstammungsvarianten darstellt. Durch die Berechnung des Kreuzvalidierungsfehlers haben wir K = 2 als besten K-Wert erhalten. (C) Manhattan-Diagramm basierend auf Fst von LW und LU.

Diese Studie präsentiert vier verschiedene Datensätze: Stuhlmetagenom, Stuhlmetabolom, Blutmetabolom und Gesamtgenom. Rohdaten für das Metagenom und das Genom werden im NCBI Sequence Read Archive im Fastq-Format gespeichert. Wir haben vorläufige Qualitätskontrollen und statistische Analysen durchgeführt. Es werden ergänzende Tabellen mit taxonomischen Verhältnissen bereitgestellt.

Die rohen Fastq-Dateien für metagenomische Sequenzierungsdaten sind in der NCBI SRA-Datenbank unter BioProject PRJNA74789367 (NCBI-Zugangsspalte in der Ergänzungstabelle S11) mit dem Projekttitel „Metagenomische Daten von Laiwu-Schweinen und Lulai-Schweinen“ verfügbar. Die rohen Fastq-Dateien für WGS-Daten (Whole Genome Sequencing) sind auch in der NCBI SRA-Datenbank unter BioProject PRJNA74911568 (NCBI-Beitrittsspalte in der Ergänzungstabelle S12) mit dem Projekttitel „Whole Genome Sequencing Data of LW and LL“ verfügbar.

Die Rohdateien für Stuhlmetabolom- und Blutmetabolomdaten werden in der MetaboLights-Datenbank69 unter der eindeutigen Studienkennung MTBLS39776970 gespeichert. Der Projekttitel lautet „Integrierte Mikrobiom-Metabolom-Genom-Achsendaten von Laiwu- und Lulai-Schweinen in China“.

Wir führten eine Qualitätskontrolle und vorläufige Analyse der Rohdaten aus mehreren Omics durch, um eine schnellere Wiederverwendung durch Wissenschaftler zu ermöglichen. Die vorläufigen statistischen Daten können durch ergänzende Informationen abgerufen werden. Gleichzeitig wurde der Anhang der Excel-Version auf http://alphaindex.zju.edu.cn/ALPHADB/download.html hochgeladen. Zu den ergänzenden Informationen gehören:

Tabelle S1: Stammklassifizierungsverhältnis für jede Probe.

Tabelle S2: Gattungsklassifizierungsverhältnis für jede Probe.

Tabelle S3: Vollständige Liste der fäkalen Metaboliten für Laiwu-Schweine und Lulai-Schweine.

Tabelle S4: Vollständige Liste der Blutmetaboliten für Laiwu-Schweine und Lulai-Schweine.

Tabelle S5: 81 verschiedene Blutmetaboliten zwischen Laiwu-Schweinen und Lulai-Schweinen.

Tabelle S6: Saubere Dateninformationen für das gesamte Genom.

Tabelle S7: 811 annotierte Gene für die oberen 1 % Fst.

Tabelle S8: 2.930 Gene für Fettgewebe, vorhergesagt aus SNPs mit dem FarmGTEx TWAS-Server.

Tabelle S9: Starke Korrelation zwischen vorhergesagten Genen und Treponema.

Tabelle S10: Annotation zur funktionellen Anreicherung für Fst und RNA unter Verwendung von GO und KEGG.

Tabelle S11: NCBI SRA-Beitrittsspalte für PRJNA747893.

Tabelle S12: NCBI SRA-Beitrittsspalte für PRJNA749115.

Um die Authentizität der Proben sicherzustellen und eine Kontamination während des Probenahmevorgangs zu verhindern, wurden Einweg-PE-Handschuhe verwendet, um Kotproben unmittelbar nach dem Stuhlgang der Zielschweine zu sammeln. Anschließend wurden die Proben in spezielle Röhrchen zur Aufbewahrung von Stuhlproben überführt und ihre eindeutigen Proben-IDs mit den DNA-Extraktions- und Sequenzierungs-IDs abgeglichen. Die Qualität der DNA wurde mit einem NanoDrop 2000-Spektrophotometer und Agarosegelelektrophorese bestätigt. Mit NovaSeq wurde eine qualitativ hochwertige DNA-Sequenzierung durchgeführt. 6000-Sequenzierungstechnologie. Rohdaten aus der metagenomischen Sequenzierung und der Sequenzierung des gesamten Genoms wurden einer Qualitätskontrolle unterzogen, um qualitativ hochwertige Messwerte für die weitere Analyse zu erhalten. Die Q30-Werte für die rohen metagenomischen Sequenzierungsdaten von 16 Proben lagen zwischen 91,65 % und 95,8 %. Nach der Qualitätskontrolle lagen die Q30-Werte zwischen 91,67 % und 95,78 %. Für Rohdaten des gesamten Genoms betrug der Q30-Bereich 88,55 % bis 90,45 %, während der Q30-Bereich der sauberen Messwerte nach der Qualitätskontrolle 89 % bis 91 % betrug. Um die Häufigkeit metagenomischer Gene zu kontrollieren, wurde die Normalisierung von Transkripten pro Million (TPM) verwendet. Der Gesamtionenstrommodus (TIC) von QC-Proben im positiven und negativen Ionendetektionsmodus wurde festgelegt und verglichen. Die Reaktionsstärke und die Retentionszeit jedes chromatographischen Peaks waren zufällig, was darauf hinweist, dass der Gerätefehler minimal und die Datenqualität zuverlässig war.

Die für die Datenverarbeitung und -analyse sowie die Bilderzeugung in dieser Studie erforderliche Software ist zugänglich, die Softwareversionen sind wie folgt:

1. Trimmomatic (v0.39, http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic)

2. BWA (v0.7.17, http://bio-bwa.sourceforge.net)

3. Megahit (http://i.cs.hku.hk/~alse/hkubrg/projects/idba_ud/)

4. MetaGeneMark (v3.25, http://exon.gatech.edu/meta_gmhmmp.cgi)

5. CD-HIT (http://www.bioinformatics.org/cd-hit/)

6. SOAPaligner (http://soap.genomics.org.cn/)

7. BLASTP (BLAST v2.2.28+, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

8. MSDIAL (v4.7, http://prime.psc.riken.jp/compms/msdial/main.html)

9. SIMCA-P (v14.1)

10. Fastp (v0.20.0, http://opengene.org/fastp/fastp)

11. Samtools (v1.10)

12. Parallel (v0.7.1)

13. Mos Depth (v0.2.9)

14. Picard Tools (v2.0.1)

15. Bcftools (v1.939)

16. GATK (v4.1.6)

17. Plink (v1.9, Vollständiger Flaggenindex – PLINK 1.9 (cog-genomics.org))

18. Beimischung (v 1.3.0)

19. VCFtools (v0.1.13)

20. FarmGTEx TWAS-Server (http://twas.farmgtex.org/)

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Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt vom National Key Research and Development Program of China (2021YFD1200802), dem Shandong Provincial Key R&D Program of China (2021LZGC001), der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nummer: U21A20249, 32272833) und dem Zhejiang Provincial Key R&D Program von China (2021C02008).

Abteilung für Tierwissenschaften, Fakultät für Landwirtschaft und Biologie, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200240, VR China

Xueshuang Lai, Qamar Raza Qadri und Yifei Fang

Abteilung für Tierwissenschaften, Hochschule für Tierwissenschaften, Zhejiang-Universität, Hangzhou, 310030, VR China

Xueshuang Lai, Zhenyang Zhang, Zhe Zhang, Shengqiang Liu, Zitao Chen, Yifei Fang, Zhen Wang, Yuchun Pan und Qishan Wang

Hainan-Institut, Zhejiang-Universität, Sanya, 310014, VR China

Shengqiang Liu, Yuchun Pan und Qishan Wang

Abteilung für Tierwissenschaften, Hochschule für Tierwissenschaften, Jilin-Universität, Changchui, 130015, VR China

Chunyan Bai

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Yuchun Pan und Qishan Wang konzipierten und gestalteten diese Studie. Xueshuang Lai schrieb das Manuskript. Zitao Chen und Chunyan Bai sammelten die Proben. Xueshuang Lai und Zhenyang Zhang bauten die DNA-Bibliotheken auf führte die Datenanalyse durch. Qishan Wang, Zhe Zhang, Qamar Raza Qadri und Yifei Fang haben das Manuskript bearbeitet. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Yuchun Pan oder Qishan Wang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lai, X., Zhang, Z., Zhang, Z. et al. Integrierte Mikrobiom-Metabolom-Genom-Achsendaten von Laiwu- und Lulai-Schweinen. Sci Data 10, 280 (2023). https://doi.org/10.1038/s41597-023-02191-2

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Eingegangen: 13. September 2022

Angenommen: 27. April 2023

Veröffentlicht: 13. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41597-023-02191-2

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